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雷帕霉素靶蛋白-DNA 甲基转移酶1 轴介导血管内皮功能障碍以响应扰流

最早的动脉粥样硬化病变通常起源于非随机模式,优先发生在动脉分支和弯曲处,那里普遍存在不稳定的血流紊乱。由扰动流产生的剪切应力很低,并且会来回振荡。扰动流诱导功能失调的内皮细胞(EC)表型,启动并延续促动脉粥样硬化。相比之下,动脉的直线部分受到脉动式单向层流的保护,因此相对具有抗动脉粥样硬化性。


据报道 DNA 甲基转移酶 (DNMT) -1 和-3A 被扰动流上调,以促进血管内皮细胞中的促动脉粥样硬化表型。然而,扰流上调 DNMTs 的信号通路尚不清楚。DNMTs 引起 EC 基因表达和功能变化的机制仍然缺乏。

血管内皮细胞中可被剪切应力激活的机械转导网络的映射表明了一系列信号通路及其关键节点,包括整合素、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPKs) 和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。通过研究平行平板流动通道中的 ECs,模拟动脉粥样硬化保护流的脉冲剪切(PS)或模拟动脉粥样硬化流的振荡剪切(OS)表明,OS 诱导 mTOR 及其效应核糖体蛋白 S6 激酶(p70S6K)的持续磷酸化。有证据表明PI3K / mTOR/ p70S6K 通路对 EC 增殖,存活和迁移是必需的。

动脉粥样硬化易感的内皮特点是促动脉粥样硬化基因的表达升高以及随之而来的异常增殖、迁移和促炎反应。通过对 ECs 应用扰流或 OS 诱导的促动脉粥样硬化基因包括细胞周期蛋白A (CCNA2) 和结缔组织生长因子 (CTGF) ,发现这些基因在动脉粥样硬化斑块中高度表达。

以此为起点,北京大学医学部基础医学院周菁团队和加州大学圣地亚哥分校生物医学工程系进行了合作研究,检测了 DNMT1 依赖性启动子甲基化在 EC 细胞周期蛋白A 和 CTGF 表达的流量调节中的作用以及功能后果,还发现了 DNMT1 的 OS 特异性上调的机械转导机制。

雷帕霉素靶蛋白-DNA 甲基转移酶1 轴介导血管内皮功能障碍以响应扰流


为了研究不同剪切应力模式对内皮 DNMT1 表达的时间调控,将 0.5 ± 4 dyn/cm2 的 OS 或 12 ± 4 dyn/cm2 的 PS 在 6h 的时间过程中应用于人脐静脉 ECs(HUVEC)。与静态条件下的对照细胞相比,OS 逐渐诱导 DNMT1 的表达,并且在剪切 6h 后表达持续升高。这种诱导持续超过 24h的 OS 应用。相反,在暴露于 PS 的 ECs 中观察到 DNMT1 表达的快速诱导;然而,诱导是短暂的,并在剪切 6h 后恢复到基础水平。


接下来探讨了 DNMT1 在 OS 诱导的内皮细胞迁移和增殖中的介导作用。实验发现,ECs 暴露于 OS 加速了细胞迁移并促进了异常细胞增殖;DNMT1 沉默消除了这些影响。这些观察结果表明 DNMT1 在介导 OS 诱导的内皮功能障碍中具有促迁移和促增殖作用。活性氧 (ROS) 的产生和循环单核细胞对内皮的粘附与内皮炎症有关。实验发现暴露于 OS 的 ECs 中 ROS 产生增加和 THP-1 单核细胞粘附增强。DNMT1 的沉默抑制了 OS 诱导的 ROS 的产生,并降低了粘附在内皮单层上的 THP-1 单核细胞的相对数量。

总之,这些结果表明 DNMT1在体外介导了 ECs 上 OS 的功能调节,沉默DNMT1 改善 OS 诱导的内皮功能障碍


为了深入了解 DNMT1 在动脉粥样硬化中的体内相关性和功能影响,实验检查了动脉粥样硬化斑块中 DNMT1 的表达和其底物 DNA 胞嘧啶-5 的整体甲基化。WT 小鼠对照组主动脉在动脉壁中显示出 DNMT1 和甲基化胞嘧啶-5(5-meC)的微弱信号。相比之下,在 EC 层和斑块中都观察到了 DNMT1 和 5-meC 的明显染色。这些发现揭示了 DNMT1 表达和 DNA 高甲基化在动脉粥样硬化病变中的高流行率,而不是在未患病区域。


为了探索 DNMT1 在扰流诱导的内皮失调和动脉粥样硬化中的参与,实验研究了小鼠颈动脉部分结扎模型内皮中 DNMT1 的表达和 DNA 甲基化。与正常区域相比,血流扰动加速的动脉粥样硬化模型在 EC 层和病变区域显示出上调的 DNMT1 表达和 DNA 甲基化。总之,DNMT1 表达和整体 DNA 甲基化水平在动脉粥样硬化内皮中升高,DNMT1 表达与动脉粥样硬化之间的强相关性表明 DNMT1 对动脉粥样硬化有积极的贡献。


实验接下来评估了部分结扎模型中 DNMT1 特异性沉默的功能后果。对于血管 DNMT1 的敲低,小鼠接受了表达 GFP 和靶向鼠 DNMT1 ( ad- mshDNMT1) 的重组腺病毒的局部腔内孵育。


观察到与未结扎的动脉相比,部分结扎的动脉内皮中 DNMT1 的表达增加。免疫荧光还表明,增殖细胞核抗原 (PCNA)、血管细胞粘附分子1 (VCAM1) 和细胞间细胞粘附分子1 (ICAM1) 在带有对照病毒的结扎颈动脉的血管壁中显著表达,与未手术的右侧颈动脉组和 ad-mshDNMT1 孵育组相比PCNA 的核表达显示细胞增殖,而内皮粘附分子 VCAM1 ICAM1 促进循环单核细胞在内皮上的积累。这些结果表明 DNMT1 在体内促进内皮增殖和炎症反应。

此外还研究了 ad- mshDNMT1 使 DNMT1 沉默对动脉粥样硬化形成的影响。对照组病毒腔内孵育的结扎动脉在手术 4 周内迅速发展为动脉粥样硬化,而 ad-mshDNMT1 孵育的动脉中粥样硬化明显减弱总之,这些发现提供了强有力的证据,表明 DNMT1 沉默通过减少动脉壁的内皮增殖和促炎症来预防动脉粥样硬化。


接下来,体外研究证明了整合素-MAPK-mTOR 级联在介导剪切应力诱导 DNMT1 表达中的重要性。来自体内实验的证据证实了这种信号传导机制,通过反复在腹腔注射雷帕霉素可抑制 WT 小鼠左颈动脉内皮细胞 DNMT1 的表达。在体外和体内研究强烈支持原理图中所总结的信号转导模型。


最后,研究人员,通过对结扎的小鼠颈动脉中的细胞周期蛋白 A 和 CTGF 进行免疫荧光染色,在有或没有管腔内沉默 DNMT1 的情况下,体内验证了 DNMT1 对细胞周期蛋白 A 和 CTGF 的靶向。总之,该结果表明,扰流会影响内皮功能并以 mTOR/DNMT1 依赖性方式诱导动脉粥样硬化。从这项研究中获得的结论可能有助于进一步评估动脉粥样硬化病理发展过程中内皮功能的表观遗传调控,并为该疾病的预防和治疗提供新的靶点。



参考文献:Zhang YP, Huang YT, Huang TS, Pang W, Zhu JJ, Liu YF, Tang RZ, Zhao CR, Yao WJ, Li YS, Chien S, Zhou J. The Mammalian Target of Rapamycin and DNA methyltransferase 1 axis mediates vascular endothelial dysfunction in response to disturbed flow. Sci Rep. 2017 Nov 8;7(1):14996. doi: 10.1038/s41598-017-15387-5. PMID: 29118325; PMCID: PMC5678172.
原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/29118325/

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