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来自 HMSCs 和 HPLFs 的条件培养基在循环拉伸刺激下促进小鼠颅骨缺损的骨愈合

由外伤或疾病引起的骨缺损的重建需要一定量的自体骨或其他移植替代物。自体骨移植被认为是一种有效的骨缺损重建方法。然而,自体骨的使用限制了可以采集的骨量。与自体骨相比,β-磷酸三钙和羟基磷灰石等生物材料具有无限可用性的优势,但植入后存在感染风险,并且其成骨诱导性较差。


干细胞疗法使用从骨髓、脂肪和牙髓以及其他来源收集的细胞,对骨再生具有有益作用。最近的研究表明,从人骨髓间充质基质细胞 (hMSCs) 收集的条件培养基 (CM) 可促进成骨和血管生成 。CM中含有多种与成骨和血管生成相关的生长因子,如骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2)、转化生长因子β1(TGF-β1)等。这些生长因子即使在低浓度下也能协同促进骨形成。

机械应力也已知是影响骨代谢的刺激物。此外,有报道称骨组织和骨祖细胞在体外和体内对机械应力有反应。据报道,通过加载循环拉伸刺激,骨形成因子(BMP、TGF-β1等)在hMSCs、骨膜和成纤维细胞中分泌增强。然而,对来自拉伸刺激下培养的细胞的 CM 进行的研究很少,并且没有对 CM 进行足够的体内分析。

基于此,日本名古屋大学医学研究生院口腔颌面外科的专家学者进行了深入研究。在该实验中,在循环拉伸刺激下培养了 hMSCs 和人牙周膜成纤维细胞 (HPLFs)。循环拉伸刺激不仅在体外而且在体内都为CM带来了更大的成骨和血管生成潜力。研究发现表明来自干细胞的 CM 的生物学效应可以通过培养条件来改变,使用 CM 进行骨再生治疗具有更有效的治疗潜力。





来自 HMSCs 和 HPLFs 的条件培养基在循环拉伸刺激下促进小鼠颅骨缺损的骨愈合


图1 研究概要:
(A) 在拉伸/非拉伸刺激下孵育24小时后,对收获的细胞进行 qPCR 。
在拉伸组中,细胞被循环单轴拉伸(5% 伸长率)24小时(0.17 Hz,37°C,5% CO2)。在非拉伸组中,细胞不接受循环拉伸刺激。
(B) 对收集的CM进行 ELISA、茜素红 S 染色、小管形成试验和体内分析(非拉伸CM [N-CM] 、拉伸 CM [S-CM])。



拉伸刺激对成骨和血管生成特性的影响

qPCR 的结果表明,在循环拉伸刺激下培养的细胞中(HPLFs/hMSCs) ,成骨 (BMP-2、BMP-4) 和血管生成 (VEGF-A、PDGF-AA) 因子显著上调。

来自 HMSCs 和 HPLFs 的条件培养基在循环拉伸刺激下促进小鼠颅骨缺损的骨愈合


图2 HPLFs 和 HMSCs 在非拉伸和拉伸条件下的成骨和血管生成基因的表达



HPLFs/HMSCs CM 对体外血管生成和矿化的影响

使用 HUVECs 进行管形成试验以评估 CM 的血管生成活性。在HPLFs 和 hMSCs 的每个 CM 样本中,与 DMEM 相比,N-CM 组的 HUVECs 的管形成增加,与 N-CM 相比,S-CM 组的管形成增加。各细胞组S-CM组的分支点数(2.5 ~ 2.9倍)、管长度(1.5 ~ 1.7倍)和管形成面积(1.7 ~ 1.8倍)均显著大于N-CM组。hMSC组的分支点数、管长度和管形成面积显著大于HPLF组。

为了评估 CM 的钙化潜力,用具有高钙化潜力的 hFOBs 进行茜素红 S 染色。与 DMEM 相比,hFOBs 在每个细胞组的 N-CM 和 S-CM 培养物中产生了更多的矿物质沉积物。在每个细胞组中,S-CM 的钙化能力比 N-CM 高1.8 ~ 2.6倍。与 HPLF 组相比,hMSC 组的钙化增加。


CM对小鼠颅骨缺损模型骨愈合的影响

在术后第 28 天进行苏木精和伊红染色以评估成骨情况。在缺损组和 DMEM 组中,缺损处分别被纤维组织和胶原支架填充,几乎没有成骨,而在 N-CM 和 S-CM 组中各细胞类型均有成骨。每种细胞类型的 CM 在 S-CM 组中显示出比 N-CM 组更大的成骨。


在术后第 14 天对组织进行荧光免疫染色,以阐明 CM 对骨愈合的影响并评估血管生成。HPLF和hMSC细胞组中,N-CM和S-CM组显示血管内皮细胞标志物CD31-阳性细胞发生血管新生;在每个细胞组中,与N-CM组相比,S-CM组的血管生成增加了2.6-3.6倍(P < 0.05)。相比之下,HPLFs 和 hMSCs 之间没有显著差异。


总之,从 HPLFs 和 hMSCs 中获得的 CM 的生物学效应可以通过变动培养条件来改变。循环拉伸刺激了每种细胞类型分泌的成骨和血管生成因子的上调。在拉伸条件下培养的 HPLFs 和 hMSCs 的 CM 的可促进小鼠颅骨缺损的血管生成和成骨。因此,细胞分泌的旁分泌因子可以通过改变培养条件进行优化,以用于骨形成的治疗。



参考文献:Ogisu K, Fujio M, Tsuchiya S, Tsuboi M, Qi C, Toyama N, Kamio H, Hibi H. Conditioned media from mesenchymal stromal cells and periodontal ligament fibroblasts under cyclic stretch stimulation promote bone healing in mouse calvarial defects. Cytotherapy. 2020 Oct;22(10):543-551. doi: 10.1016/j.jcyt.2020.05.008. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32798177.
原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/32798177/
图片来源:所有图片均来源于参考文献

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