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机械拉伸通过P38/ATF3通路和miR-421的转录后调控调节ACE2 诱导平滑肌细胞功能障碍

高血压是心血管疾病 (CVD) 的主要危险因素,可导致血管结构和功能异常。高血压通常伴随着血管壁机械拉伸的增加。因此,过度的机械拉伸会影响血管细胞,例如内皮细胞 (ECs)、血管平滑肌细胞 (VSMCs) 和外膜成纤维细胞,并导致这些细胞功能障碍 ,从而引起血管结构和功能异常。


虽然牵张力可以影响所有血管细胞,但位于血管壁中膜的 VSMCs 是主要的靶细胞。在生理条件下,VSMCs 很少发生增殖和迁移,通常表现出收缩表型。然而,在异常的机械牵张力下,VSMCs 发生表型转变,表现为增殖、迁移和细胞外基质合成增加,从而导致动脉壁增厚和变硬。

肾素血管紧缩素系统(RAS)与心血管疾病密切相关。ACE2 是 ACE 的同源物,但在底物特异性方面与 ACE 不同。ACE2 对动脉粥样硬化的保护作用已在各种研究中得到证实。这种酶在人和动物,包括大鼠和小鼠的正常和病变血管中都有表达。它在不同的细胞类型中含量丰富,例如 ECs、VSMCs 和巨噬细胞。

人们普遍认为 RAS 系统与机械刺激密切相关。机械拉伸通过上调大鼠 SMCs 中的 AT1 受体来促进血管损伤。也有研究证实,内皮细胞暴露于剪切应力下可通过 p53 和 miR-143/145 转录后调控降低 ACE 的表达。

来自中国医学科学院、山东大学齐鲁医院等机构的专家团队先前证明, ACE 可以介导 SMCs 的机械拉伸诱导的表型调控。然而,血管细胞中 ACE2 表达的调控机制,尤其是机械刺激的调控机制尚不清楚。有一项研究发现 ACE2 在低剪切应力诱发的颈动脉斑块中含量丰富,因此研究人员推测 ACE2 也具有机械反应性,可能参与了机械拉伸诱导的血管重构。

基于此,该团队进一步研究,于 Frontiers in Physiology 上联合发表了了题为《Mechanical Stretch Induces Smooth Muscle Cell Dysfunction by Regulating ACE2 via P38/ATF3 and Post-transcriptional Regulation by miR-421》的研究成果。

在该研究中,建立了腹主动脉缩窄模型,以研究 ACE2 在体内血管建模中的作用。在体外研究中,VSMCs 在指定的时间内进行机械拉伸。该研究的目的是探索 ACE2 在机械拉伸下的 VSMCs 的功能中所起的作用,以及这一过程的可能机制。

实验结果


大鼠体内腹主动脉缩窄影响 ACE2 和 ACE 的表达


在大鼠中进行腹主动脉缩窄模型以诱导压力超负荷,结果表明,ACE2 和 ACE 都对血压引起的机械拉伸有响应。然后,实验收集了合并或不合并高血压的结直肠癌患者的癌旁组织, 其中 6 例有高血压病史。结果显示,在高血压患者中,包括不同大小的动脉,平滑肌细胞中 ACE2 的表达明显减少。


机械拉伸在体外调节血管平滑肌细胞中 ACE2/Ang-(1-7) 和 ACE/AngII 的表达

由于 VSMCs 是机械拉伸升高的主要靶细胞,该研究重点关注 VSMCs 的功能。在这里,使用机械拉伸加载系统,结果发现,在指定时间内进行机械拉伸的 VSMCs 在 mRNA 和蛋白质水平上都显示出 ACE2 的表达降低,从 6 小时开始显著降低(P < 0.05),而 ACE 的表达增加( P < 0.05)。ACE2 酶活性也在拉伸下下降(P < 0.05)。

ACE2 的保护作用与其降解血管收缩剂 (AngII) 和产生血管舒张剂 [Ang-(1-7)] 的能力有关,因此实验还评估了细胞质蛋白中 Ang-(l-7) 和 AngII 的水平。Ang-(l-7) 水平下降,而 AngII 水平在拉伸下随时间增加(P < 0.05)。

ACE2 对机械拉伸诱导的 VSMC 增殖、迁移、凋亡和胶原代谢的影响


机械牵张可能调节 VSMCs 增殖、迁移和表型转化等功能,与静态对照相比,18% 的机械拉伸12h 显著促进了 VSMCs 的增殖,而 ACE2 的过表达部分挽救了因拉伸产生的增殖(P < 0.05)。细胞划痕实验表明,拉伸条件下,VSMCs 的迁移距离明显受到刺激,而机械拉伸对迁移的促进作用被 ACE2 过表达部分抵消(P < 0.01)。此外,ACE2 的过表达逆转了机械拉伸诱导的细胞凋亡和胶原合成(P < 0.05)。

总之,结果表明 ACE2 参与了机械牵张诱导的 VSMC 功能障碍


p38 MAPK/ATF3 通路参与机械拉伸下 ACE2 的表达


最近的一项研究表明,Ang II 通过 AT1-ERK/p38 MAP 激酶通路下调 ACE2。该团队发现机械拉伸诱导了 p38 MAPK、JNK 和 ERK1/2 的磷酸化(P < 0.05)。为了验证这些结果,VSMCs 用 p38 MAPK 抑制剂 SB203580、JNK 抑制剂 SP600125 或 ERK1/2 抑制剂 PD98059 预处理 1 小时,然后细胞进行 18% 的拉伸持续 12 小时。

结果表明,SB203580 能显著减弱牵张诱导的 ACE2 下调(P < 0.05)。当暴露于 18% 的机械拉伸时,ATF3 的表达增加,SB203580 阻断了该诱导(P < 0.05)。这一结果与之前认为 ATF3 的激活是通过 p38 MAPK 通路的研究相一致。

然后,使用 ATF3 siRNA 转染 VSMCs,发现 ATF3 的敲低逆转了机械拉伸导致的 ACE2 水平下调(P < 0.05)。免疫荧光显示,在 18% 的拉伸下,细胞核区域的 ATF3 水平升高,这表明机械拉伸通过促进 ATF3 进入细胞核来调节 ACE2 的表达。因此,有充分的理由得出结论,机械拉伸可能通过 p38 MAPK/ATF3 途径调控表达。


ACE2 是 ATF3 的直接转录目标靶点


ACE2 的表达可能通过调节 ATF3 的表达和位置而受到机械拉伸的调节。为了进一步确定 ATF3 是否可以调控 ACE2,实验使用 JASPAR 数据库分析了 ACE2 启动子序列中潜在的 ATF3 结合位点。最终数据表明, ACE2 是 ATF3 的直接转录靶点。


miR-421 参与机械拉伸下 ACE2 的表达

为验证 miRNAs 是否参与 ACE2 表达的调控,采用 Dicer siRNA 干扰 Dicer 酶的表达,阻断 miRNAs 的合成。在研究中发现,miR-421 的水平在 18% 的机械拉伸下增加,因此,在以下实验中重点关注 miR-421。接下来实验证实,miR-421 直接靶向 ACE2-3'-UTR。

为了进一步验证 miR-421 对 ACE2 表达的影响,用 miR-421 模拟物、抑制剂或 NC 序列转染VSMCs。上述结果表明 miR-421 通过直接结合 3'-UTR 负向调控 ACE2 的表达。然而,miR-421 是否参与拉伸调节的 ACE2 仍是未知数。在用 miR-421 抑制剂转染 VSMCs 后,实验评估了机械拉伸下 ACE2 的表达。miR-421 抑制剂显著减弱了拉伸诱导的 ACE2 表达的下调。这些结果表明,miR-421 参与了机械拉伸对 ACE2 表达的调控。

机械拉伸通过P38/ATF3通路和miR-421的转录后调控调节ACE2 诱导平滑肌细胞功能障碍

图形概要

机械牵张可能通过 p38 MAPK/ATF3 途径促使 ATF3 易位进入细胞核,从而降低保护因子 ACE2 的水平,并通过 miR-421 的转录后调控直接与 ACE2 启动子结合。



总之,实验数据显示,病理性机械拉伸通过 p38 MAPK/ATF3 通路和 miR-421 的转录后调节抑制 ACE2 的表达,促进了高血压过程中的 VSMC 功能障碍和血管重塑。更好地了解 ACE2 在血管重塑发展中的作用可能为临床医生提供开发新疗法的机会。




参考文献:Liu X, Liu X, Li M, Zhang Y, Chen W, Zhang M, Zhang C, Zhang M. Mechanical Stretch Induces Smooth Muscle Cell Dysfunction by Regulating ACE2 via P38/ATF3 and Post-transcriptional Regulation by miR-421. Front Physiol. 2021 Jan 18;11:540591. doi: 10.3389/fphys.2020.540591. PMID: 33536929; PMCID: PMC7848200.

原文链接:https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33536929/

图片来源:所有实验过程图均来源于参考文献


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