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转录因子 ERG 调节微血管系统中低剪切应力诱导的抗血栓形成途径

止血是一种生理机制,旨在通过在受伤后形成血凝块来维持血管完整性。一个健康内皮细胞的重要功能是通过对许多促凝和抗凝基因的精细调控来维持一个基本的抗血栓状态。在由内皮细胞 (EC) 控制的多种促凝和抗凝途径中,血栓调节蛋白 (TM) 是调节凝血和血栓形成的关键参与者。根据其抗凝和抗炎作用,TM与多种炎症和缺血性病理有关,如静脉血栓栓塞、出血性疾病、冠状动脉疾病和动脉粥样硬化等。


先前的研究表明,不同的外部刺激能够转录调节 TM。层流剪切应力 (SS) 已被证明上调 TM 表达,而炎症细胞因子如 TNF-α 通过转录因子 (TF) NF-κB 抑制 TM 表达。多个 TF 参与了TM表达的调控,包括 Krüppel 样因子 2 (KLF2)。KLF2 已被证明可以在静态、低SS 和高SS 条件下调节 EC 中的 TM 水平。由 KLF2 介导的高SS 上调 TM 表达,这是大动脉中重要的保护性抗血栓和抗动脉粥样硬化的机制。

然而,与内皮细胞TM的缺失不同,小鼠体内 KLF2 的缺失导致 TM 表达的适度降低,并不足以引起自发性血栓形成,这表明 KLF2 需要与其他 TF 合作来调节 TM 水平并发挥其抗血栓作用,可能是在选定的血管床上。

TF ETS-related gene (ERG) 是成人分化 EC 中 E-26 转化特异性 (ETS) 家族中最丰富的成员,在所有血管床中都有表达。多项研究已经描述了 ERG 在内皮中的重要作用,比如调节血管发育和血管生成、促进血管稳态、抑制健康内皮细胞中的血管炎症等。

基于此,来自英国帝国理工学院国家心肺研究所、美国宾夕法尼亚大学医学院药理学系等领域的研究团队在 Nature Communications 上发表了题为《The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature》的文章。鉴于ERG的多重稳态功能,该实验假设 ERG 可能在 EC 中具有抗血栓作用,从而保护血管免受自发性血栓的形成。


实验结果


首先,为了研究 ERG 发挥其抗血栓作用的分子机制,实验使用了可诱导内皮缺失ERG (Erg iEC-KO)的成年小鼠。最后数据表明,在选定的血管床中,内皮 TF ERG是防止自发性血栓形成的关键。ERG 的缺失破坏了凝血的调节,导致肝和肺中与血栓和/或出血相关的凝血病。


其次,为了研究 ERG 发挥其抗血栓功能的分子机制,分析了 ERG 缺失的 HUVEC 的全局转录组谱,并确定了多个直接或间接参与凝血调节的基因作为 ERG 的转录靶点。这些基因在 HUVEC 中进行了 qPCR 验证。最后发现表明,ERG 可能以组织特异性的方式调节多种促凝和抗凝基因,并指出 TM 是 ERG 抗血栓作用的关键候选基因。

然后,为了测试在 Erg iEC-KO 小鼠中观察到的血栓表型是否是由于TM 表达的减少,实验使用了靶向红细胞 (RBC-TM) 的小鼠重组 TM 融合蛋白来恢复体内 TM 蛋白的活性。最后数据表明,用 RBC-TM 进行急性治疗能够显著挽救在 Erg iEC-KO 小鼠中观察到的凝血功能障碍。

接下来,实验使用体外模型来研究 ERG 控制 TM 表达的机制。通过免疫印迹 和 IF显微镜检测,与对照组 siRNA 相比,siRNA 处理12、24、48h 抑制了 HUVEC 中 ERG 表达,可导致 TM mRNA和蛋白表达下降。

ERG 还在人真皮微血管 EC (HDMEC)和人真皮血液EC (HDBEC)中调节微血管 EC 中 mRNA 和蛋白质水平的 TM 表达 。相反,ERG 过表达显著增加了 HUVEC 中的TM表达。

TM 是凝血酶介导的天然抗凝剂 APC5 激活的关键调节剂。为了研究 ERG 对 TM 表达的调控是否导致其功能的调控,实验对用 ERG siRNA 处理的 HUVEC 进行了蛋白C 激活测定,并测量了APC 随时间的产生。与降低的 TM 表达一致,ERG 缺失细胞在与蛋白C 孵育 30 分钟后显示出 APC 的产生减少,与 siCtrl 细胞相比,在 60min 时间点 APC 的生成减少最大。

这些结果表明 ERG 调节 TM 水平,从而调节 EC 中的 TM-蛋白C 系统

在体外,实验证明 ERG 与TM启动子结合并转化,并确定了一个ERG-KLF2 复合物,它协同驱动TM的表达;ERG 促进 KLF2 染色质进入、DNA 结合和TM 启动子的反式激活。


尽管在体外静态条件下,KLF2 和 TM 在 EC 中表达,但它们是重要的血流响应基因:层流剪切应力 (SS) 上调 KLF2 的表达,进而促进 TM 的表达增加。但是,ERG 是否是一个血流响应型 TF 尚不清楚。

接下来,实验首先研究了低 (5 dynes per cm2) 和高 (20 dynes per cm2) 层流SS对 HUVEC 中 ERG 和 KLF2 蛋白水平的影响。正如预期的那样,与静态条件相比,暴露于 低SS 和 高SS 的 HUVEC 中 KLF2 蛋白水平上调,相反,ERG 蛋白水平不受 SS 的影响。与静态条件相比,在低 SS 条件下 ERG-KLF2 复合物的形成增加,高 SS 没有进一步增加这种相互作用。

然后研究了 ERG 在使用 ERG 或对照 siRNA 处理的 HUVEC中,在静态、低SS 、高 SS 条件下,在调节 TM 表达中的作用。正如预期的那样,与静态条件相比,暴露于 SS 的 HUVEC 中 KLF2 和 TM mRNA 水平上调,而 ERG mRNA 水平不受影响。

重要的是,虽然 高SS 诱导了在 ERG 缺失细胞中 TM 表达的上调,但 低SS 无法诱导其上调,表明 ERG 在 低SS 条件下选择性地控制 TM 的表达,并且它对于 高SS 依赖性的 TM 调控是不可缺少的。

这些结果表明,ERG 和 KLF2 之间的合作对于 TM 在 低SS 条件下的表达是必不可少的,并表明其在高SS条件下,有其他基因/通路支持KLF2依赖性转录

HUVEC 是体外使用最广泛的 EC 模型,但不能概括来自不同血管床的 EC 的所有特性。因此,为了研究 ERG 在微血管或动脉来源的 EC 中 TM 的调节作用,实验还对人微血管 EC (HDBEC) 和人主动脉内皮细胞 (HAEC) 进行了流动实验。与 HUVEC 相比,HDBEC 实验显示出相似的结果,表明 ERG 在 低SS 条件下特异性调节 TM 的表达,在微血管 EC 中也是如此)。

最后,实验还发现,ERG 在暴露于 低SS 的微血管床中特异性调节 TM 的表达,但在暴露于 高SS 的血管(主动脉) EC 中则不然。


实验结论

总之,研究表明 ERG 对于维持内皮抗血栓环境至关重要。实验证明 ERG 是 TM 的直接转录调节因子,通过与 KLF2 合作以特定的方式驱动其表达。

鉴于血栓性疾病对特定器官的血管床表现出选择性偏好,血管床特异性通路的识别对人类病理具有潜在的重要意义。该途径可能参与与微血管血栓形成和/或凝血病相关的人类疾病的发病机制,例如弥散性血管内凝血、溶血性尿毒症综合征或败血症。

参考文献:Peghaire C, Dufton NP, Lang M, Salles-Crawley II, Ahnström J, Kalna V, Raimondi C, Pericleous C, Inuabasi L, Kiseleva R, Muzykantov VR, Mason JC, Birdsey GM, Randi AM. The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature. Nat Commun. 2019 Nov 1;10(1):5014. doi: 10.1038/s41467-019-12897-w. PMID: 31676784; PMCID: PMC6825134.


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